Cromatografia

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Un apparato per FPLC (fast protein liquid cromatography) esposto al Science Museum di Londra

La cromatografia, nata come tecnica separativa e sviluppatasi in seguito anche come tecnica analitica, si basa sul fatto che i vari componenti di una miscela tendono a ripartirsi in modo diverso tra due fasi, in funzione della loro affinità con ciascuna di esse.

Mentre una fase rimane fissa (la fase stazionaria), ed è generalmente un solido o un gel, un'altra fase, liquida o gassosa, la fase mobile fluisce su di essa trascinando con sé in quantità maggiore i componenti della miscela che più risultano affini ad essa.

Indice

Breve storia

L'invenzione della cromatografia viene attribuita al biochimico russo Michail Cvet (pronunciato e a volte trascritto Tswett) nel 1906, quando riuscì, con questa tecnica, a separare la clorofilla da un estratto vegetale.
Cvet procedette ponendo una piccola quantità di estratto alla sommità di una colonna di vetro piena di polvere di carbonato di calcio e lavando successivamente il campione facendo percolare attraverso la colonna dell'etere di petrolio. A mano a mano che l'etere di petrolio fluiva trascinando con sé il campione, questo si separava in bande di diverso colore (da qui il nome "cromatografia"), ciascuna delle quali procedeva verso il fondo della colonna con diversa velocità.

Con il suddetto esperimento Cvet mise in evidenza la possibilità di impiegare questo sistema di frazionamento, creando le basi della moderna cromatografia. Il termine si richiama alla separazione di bande di diverso colore e viene ancor oggi utilizzato anche se raramente la separazione si basa sulla differenza cromatica. Questa tecnica è oggi infatti applicata all'analisi di sostanze anche incolori, utilizzando il trasferimento tra le fasi con procedimenti più elaborati ed apparecchiature che possono avere notevole complessità.

Con il termine cromatografia oggi si indicano in genere tutte le varie tecniche separative, applicabili a miscele di sostanze e basate sulla distribuzione fra due fasi in cui si utilizza uno stesso principio, la diversa velocità con cui i differenti componenti di una miscela migrano in una fase stazionaria sotto l'influenza di una fase mobile, che ha il compito di trascinare lungo il sistema i soluti che costituiscono la miscela in esame.

Cromatogramma

Esempio di cromatogramma, mostrante 2 picchi separati

Quando il rivelatore posto in fondo all'apparecchio registra il passaggio di una sostanza eluita, elabora i dati su di un "cromatogramma", che rappresenta la quantità di sostanza rilevata in funzione del tempo. Ogni volta che una sostanza viene rivelata, il cromatogramma registra un picco più o meno alto a seconda della sua concentrazione. Perché un cromatogramma possa essere ritenuto accettabile deve avere una buona risoluzione. Per risoluzione si intende un parametro che mette in relazione l'efficienza, la selettività ed il fattore di ritenzione.

Fattore di capacità: è un parametro che mette in relazione il tempo di ritenzione di un analita col "tempo morto", ovvero il tempo impiegato da una sostanza non trattenuta dalla fase stazionaria per attraversare la colonna. Per tempo di ritenzione di una sostanza si intende il tempo impiegato dall'eluente (ovvero la fase mobile) per trascinarla via dalla fase fissa. Matematicamente esso è determinato dal rapporto delle moli di analita presenti nella fase stazionaria e quelle presenti nella fase mobile, ovvero:

                                                ḱ = n(s)/n(m)

Con opportune sostituzioni si arriva alla formula seguente:

                                                ḱ = t'(r)/t(0)

che risulta molto più semplice da applicare in quanto il tempo di ritenzione corretto t'(r) ed il tempo morto t(0) sono direttamente ricavabili dal cromatogramma.

Selettività: per avere una buona selettività i picchi del cromatogramma devono essere il più distanti possibili, ovvero sostanze di specie diversa devono avere tempi di ritenzione diversi. È possibile migliorare la selettività diminuendo la temperatura di lavoro. Da un punto di vista matematico, la selettività è definita come il rapporto dei fattori di capacità di due diverse sostanze sullo stesso cromatogramma, quindi:

                                               α = t'(r2)/t'(r1)

Quanto più la selettività è maggiore di 1, tanto migliore sarà la separazione cromatografica.

Efficienza: avere una buona selettività non basta. Infatti, anche se i picchi sono ben distanziati, è possibile che siano talmente larghi che si sovrappongano fra loro. Per questo è necessario che particelle di una stessa specie vengano eluite con la stessa velocità, di modo che la banda all'interno della colonna cromatografica sia il più stretta possibile. Ci sono varie teorie su come sia possibile migliorare l'efficienza. La più comune viene chiamata "Teoria dei piatti teorici". Questa si rifà al metodo della distillazione frazionata, nel quale un maggior numero di piatti permette una migliore separazione fra sostanze con diverso punto di ebollizione.

Tipi di cromatografia

Apparecchiatura complessa per la gascromatografia

Dal primo esperimento di Cvet la tecnica si è estremamente evoluta. Oggi esistono vari tipi di cromatografie, generalmente classificate in funzione della natura delle fasi stazionaria e mobile. La seguente tabella ne riassume alcune

tipo fase stazionaria fase mobile
gascromatografia (GC) solida o liquida supportata su solido gas
cromatografia liquida (LC) solida liquida
cromatografia su strato sottile (TLC)[1] solida liquida
cromatografia a scambio ionico (IEC) solida liquida

All'interno delle precedenti categorie si possono avere ulteriori suddivisioni. In particolare la cromatografia liquida si suddivide in cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) e cromatografia liquida classica (utilizzata a scopo preparativo); inoltre vi è un'ulteriore suddivisione basata sul meccanismo di separazione: si distinguono infatti la la cromatografia di affinitá, di adsorbimento, ionica, nonché la cromatografia a permeazione di gel (impiegata nella separazione dei polimeri in funzione del loro peso molecolare).

L'utilizzo di fasi stazionarie chirali consente anche la separazione di miscele racemiche in enantiomeri puri.

L'elettrocromatografia, sfruttando un campo elettrico applicato a 90° rispetto al flusso del solvente, rappresenta una variante più pratica e più veloce rispetto alla classica cromatografia liquida su carta. La separazione è attuata in senso discendente e si ottengono percorsi divergenti, dall'alto in basso, a partire dal punto di semina.

Voci correlate

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